關(guān)鍵詞:Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧，承諾客戶不成功不收費(fèi)。在獲得重組蛋白產(chǎn)品的同時(shí)，我們也會(huì)提供相應(yīng)的原始數(shù)據(jù)和原始圖片,不需要再額外花費(fèi)精力重復(fù)實(shí)驗(yàn)。另一方面，我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
1材料準(zhǔn)備：
可拍照顯微鏡，Transwell小室，孔徑8μm，沒(méi)包被膠的(Coster和Corning公司的也較常用)，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板24孔板。細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購(gòu)買的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，無(wú)血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培養(yǎng)基，DMEM完全培養(yǎng)基，1640完全培養(yǎng)基（也可加到20%血清），無(wú)菌PBS，棉簽，胰酶（0.25?TA胰酶），4%多聚甲醛固定液或者甲醇，結(jié)晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS結(jié)晶紫）
2步驟和流程
2.1基質(zhì)膠鋪板：
用BD公司的Matrigel 1：8（根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)生mmp的量來(lái)決定）稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進(jìn)行基底膜水化。
2.2制備細(xì)胞懸液
①制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12－24h，進(jìn)一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。
②消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的無(wú)血清（或者1?S）培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/ml。
2.3接種細(xì)胞
①取細(xì)胞懸液100μl加入Transwell小室。
② 24孔板下室一般加入600μl含20?S的培養(yǎng)基，特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會(huì)有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時(shí)候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。
③培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定）。24h較常見(jiàn)，時(shí)間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。
2.4結(jié)果統(tǒng)計(jì)
直接計(jì)數(shù)法，“貼壁”細(xì)胞計(jì)數(shù)，這里所謂的“貼壁”是指細(xì)胞穿過(guò)膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會(huì)掉到下室里面去，通過(guò)給細(xì)胞染色，可在鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。
取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無(wú)鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30分鐘，將小室適當(dāng)風(fēng)干。
0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗3遍。
400倍顯微鏡下隨即五個(gè)視野觀察細(xì)胞，記數(shù)。